1 材料和方法
1.1 材料
从健壮母株上采取幼嫩枝条作为外植体。
1.2 外植体表面灭菌方法
将圃地采回的生长健壮、无病虫害的幼嫩枝条用流水冲去表面的脏物,剪去叶片(留叶柄),用含洗洁精的溶液浸泡5ｍｉｎ,用棉球仔细清洗后,流水漂洗干净。在无菌条件下,用75%酒精浸泡1ｍｉｎ,转入0.15%ＨｇＣｌ中浸泡10～15ｍｉｎ,用无菌水冲洗3～4次,切成带一个叶掖的茎段,迅速接入诱导培养基,每瓶接种一个外植体[1]。
1.3 培养条件
以ＭＳ为基本培养基,附加不同种类、浓度的激素。所有培养基均加入3%白糖和0.6%卡拉胶,ｐＨ5.8。培养室温度(25±2)℃,光强1000～1500ｌｘ,光照12ｈ/ｄ。
1.4 腋芽诱导
将经灭菌处理后的茎段接种到诱导培养基上,诱导茎段上腋芽的萌发,建立无菌系。
1.5 增殖培养
待芽长到4～5ｃｍ左右,将其从原茎段切下,分切成带1～2个芽的茎段,转入增殖培养基中进行继代增殖培养,使其分化出丛生芽;基部丛生芽直接转入增殖培养基进行培养。
1.6 生根培养
将增殖培养得到有效小苗切下接入添加不同激素种类和浓度的生根培养基中,15ｄ统计生根率。生根苗经5ｄ左右炼苗后,即可移栽。
2 结果与分析
2.1 不同外植体诱导结果比较
我们采用了枝条的不同部位为外植体,Ⅰ为较嫩的顶芽;Ⅱ木质化程度略高的嫩枝茎段;经过表面消毒处理后,接种在诱导培养基上,7ｄ腋芽开始萌动。其污染率、褐化率、诱导成活率及在最适丛芽诱导培养基上丛芽诱导情况汇总见表3。从表3可看出,不同外植体对进瓶诱导的影响是很大的。Ⅰ处理污染少,诱导成活率高,但不发生丛芽。Ⅱ外植体虽污染率高些,但直接发生丛芽,有利于芽的快速增殖。
2.2 芽的增殖与生长情况
待芽长到4～5ｃｍ左右,采用微枝扦插和丛芽增值相结合的增值方式,将长芽分切成带1-2个芽的茎段,转入增殖培养基中进行继代增殖培养,使其分化出丛生芽;基部丛生芽直接转入增殖培养基进行培养。继代周期为15～20ｄ。可以看出,在以上12种培养基上,均有2以上的增殖系数。但以舔加ＢＡ和ＮＡＡ的1-6和1-7两种培养基效果最好,增殖系数大,苗粗壮。
2.4 生根培养
将增殖培养得到的2～3ｃｍ顶芽切下接入生根培养基中,可得到生根整齐,大小均匀,生长健壮的完整苗。下表是不同生根培养基中的生根效果。从表5可以看出,ＩＢＡ、ＩＡＡ能直接诱导发根,小苗基部不产生愈伤;但ＩＢＡ比ＩＡＡ更有利于根诱导,当ＩＢＡ浓度在0.5～1之间,发根快,生根率高达100%,苗高可达4～7ｃｍ,叶片大,苗粗壮;若ＩＢＡ与ＮＡＡ配合使用,则能达到更好的发根效果,发根初始时间为6ｄ,12～15ｄ后形成主根粗壮、须根发达,苗高5～8ｃｍ,叶大而浓绿粗壮小苗。但单独使用ＮＡＡ,虽根系发达,但生根慢,生根率低。
2.5 移栽
生根苗经5ｄ左右炼苗后,即可移栽。我们选择了3种不同的基质并消毒处理装袋后将苗移入,棚进行管理。30ｄ后汇总结果见表6。从表6可以看出,3种基质中以Ｃ基质效果最好,成苗率可达到91%,Ｂ而只采用黄心土作为基质,成苗率只能达到59%。小苗移栽后10ｄ左右可揭去保湿膜进行管理,再过10ｄ移到户外按常规小苗管理。
2.6 组培工厂化育苗程序
香花槐组培工厂化育苗在人工控制条件下可周年进行,程序如下:优良健壮母株选择 →外植体的采集和表面灭菌 →接种、外植体培养 →丛芽诱导 →继代培养(微枝扦插和丛芽增值相结合) →丛芽增值 →丛芽增值 →丛芽增值...↓↓↓顶芽生根顶芽生根顶芽生根...↓↓↓炼苗、移栽炼苗、移栽炼苗、移栽...↓↓↓商品苗商品苗商品苗...
3 讨 论
(1)香花槐组培苗玻化苗的预防措施。植物试管苗超度含水态(玻化)现象作为组织培养中的一个棘手问题自80年代初以来已引起人们的广泛关注[2],他普遍存在于各种植物之中而成为提高试管植物繁殖率和增殖培养过程稳定性的主要障碍。超度含水态苗通常植株矮小,呈半透明状,组织结构畸形、吸收与光合器官功能不全,几乎在所有情况下难于移栽成活[3]。从而造成人力、物力的极大浪费。本实验证明香花槐在组培过程中极易产生玻化现象,给其工厂化育苗带来了严重的影响。以往的研究中曾采取多种方法试图解决超度含水态苗的问题,如通过改变培养基中碳水化合物的中和浓度[4],改变培养过程的光照强度、光周期[5],改变培养容器的通气状况[6],改变培养基中凝胶的种类和浓度等多种方法,在不同程度上来解决超度含水态苗的问题。本研究通过提高培养基中凝胶浓度,同时以组培专用封口膜代替工厂化生产常用的塑料盖或保险膜以改善培养容器的通气状况,达到了解决香花槐在组培过程中的超度含水态苗的问题。(2)繁殖系数的提高。组培苗要实现工厂化生产的关键之一就是要有一定的增殖系数。本研究表明,在优化的培养基上,采用微枝扦插和丛芽增殖相结合的增殖方式,可使香花槐的繁殖系数达到6以上,继代周期为15～20ｄ。为此,可在短时间内繁殖出大量的优质苗木。3.3 降低生产成本香花槐适应性广的生长习性在组培过程中也得以一见,本研究采用普通食用白糖代替蔗糖,井水代替无离子水,香花槐瓶苗生长正常。从而降低了培养成本。
